INTRODUCCION
Las interacciones de un Ac con un Ag es la reacción fundamental de la inmunología. La mayoría de los Ag son proteinas. La identidad exacta de los grupos que reacciona con el Ac no se conoce. Los Ag y Ac forman complejos que se vuelven insolubles y precipitan. Esta propiedad hace posible realizar ensayos cualitativos y cuantitativos.
La precipitación del Ag, tiene varios determinantes antigenicos por molécula a los que se pueden unir los Ac. Los anticuerpos tienen dos sitios de unión al Ag, por lo que se forman grandes agregados.
ZONA DE EXCESO DE ANTICUERPOS: es la zona donde se agrega una cantidad creciente de Ag a una cantidad constante de Ac.
ZONA DE EQUICALENCIA O PUNTO DE EQUIVALENCIA: a medida de que se agrega más Ag, la cantidad de proteína precipitada aumenta hasta que las moléculas de Ag-Ac están en proporción optima.
ZONA DE EXCESO DE ANTÍGENO: ocurre cuando la cantidad de Ag en solución excede a la cantidad de Ac, la cantidad de precipitación disminuira.
Cuando los Ac y Ag se insertan en diferentes áreas de un gel de agarosa, se difunden uno hacia el otro y forman bandas opacas de precipitado en la interfaz de sus frentes de difusión.
OBJETIVO DEL EXPERIMENTO
El objetivo del este experimento es introducir los principios de las interacciones Ag/Ac usando el procedimiento Ouchterlony.
PROCEDIMIENTO DE OUCHTERLONY
La doble difusión den dos dimensiones es un procedimiento simple. Las soluciones de Ag y Ac se colocan en pocillos separados y cortados en una placa de agarosa. Los reactivos se difunden desde los pocillos uno haci aelotro y precipitan donde se encuentran en proporciones equivalentes. Un único Ag se combina con su Ac homólogo para formar una única línea de precipitación. Cuando dos Ag están presentes, cada uno se compra independientemente el uno del otro, por lo que el número de bandas de precipitación indica que hay al menos muchos pares de Ac y Ag presentes.
Está tecnica es muy útil para compara Ag para un número determinantes idénticos o de reacción cruzada.
REACCIÓN DE IDENTIDAD: se conoce como la fusión de los extremos de dos bandas de precipitación de dos Ag colocados en pocillos adyacentes y el Ac homologo.
REACCIÓN DE NO IDENTIDAD: sucede al colocar Ag no relacionados en pocillos adyacentes y en el pocillo central se colocan Ac para cada Ag, las bandas de precipitación formadas se cruzarán
REACCIÓN DE IDENTIDAD PARCIAL: consiste en la reacción cruzada de dos Ag colocados en pocillos periféricos adyacentes contra uno en el pocillos central, y se obtiene una banda única con el Ag homologo y de reacción cruzada. Como el Ag de reaccion cruzada carece de algunos determinantes antigenicos presentes en el Ag homologo, no puede precipitar todo el Ac. El Ac restante se difundirá más allá de la línea de precipitado de reacción cruzada que reacciona con el Ag homologo para producir un espolon. Este espolon formará proyecciones hacia el Ag con menos determinantes.
MATERIALES UTILIZADO
- Antisuero (Ac)
- Suero total (Ag)
- Albúmina (Ag)
- IgG (Ag)
- Tampon
- Agarosa
- Micro pipetas
- Plantillas para corte de pocillos
- Placas de Petri
PREPARACIÓN DE LA CÁMARA DE INCUBACIÓN
En una cubeta colocamos papel absorbente mojado con agua destilada. El papel debe estar empapado, y no dejado capa de agua liquida. Una vez que colocamos las placaa, debemos taparla con una envoltura de papel de aluminio y lo sellamos con cinta adhesiva.
PREPARACIÓN DE ANTICUERPO Y ANTIGENOS
Preparamos alícuotas para todos los grupos de Ac y de los tres Ag.
Etiquetados 9 eppenderf con A, otros 9 con B, otros 9 con C y los últimos 9 con D.
- En los eppendorf etiquetados con A, alícuotamos 100ul de antisuero
- En los eppendorf etiquetados con B, alícuotamos 200ul de suero total
- En los eppendorf etiquetados con C, alícuotamos 150ul de albumina
- En los eppendorf etiquetados con D, alícuotamos 80ul de IgG
A cada grupo repartimos un eppendorf de cada para realizar el ensayo.
PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA
- En un matraz aforado de 500ml, agregamos el contenido de tampón y lo diluimos en 225ml de agua destilada. Agitamos con una varilla y disolvemos completamente.
- Vertemos en contenido del sobre de agarosa y disolvemos completamente. Con un rotulador, marcamos donde está el nivel del volumen.
- Tapamos el matraz con un tapón de algodón o con un poco de paraflim y calentamos en el microondas hasta llegar a ebullición, para disolver la agarosa. Durante el calentamiento vamos agitando en varias ocasiones observando que no queden partículas pequeñas y que la agarosa se va volviendo transparente. La solución final debe ser clara y transparente.
- Si observamos que se ha evaporado, debemos agregar agua destilada hasta la línea marcada. El volumen debe ser 230 ml.
- Enfriamos la solución a 55 grados en un ba;o maría. Agitamos el matraz para facilitar la disipación del calor
- Una vez alcanzada la temperatura, tranferimos 25 ml en cada placa.
PREPARACIÓN DE PLACAS DE OUCHTERLONY
Repartimos a cada grupo 3 placas de Petri. Con una pipeta de 5ml, tranferimos a las placas para cubrir el fondo con agarosa. Debemos evitar la formación de burbujas de aire, si esto ocurre, con ayuda de una punta de pipeta la explotamos o la llevamos al lateral para que no interfiera. Dejamos enfriar en posicion horizontal hasta que solidifique. Aproximadamente 10 o 15 minutos
PREPARACIÓN DE POCILLOS PARA LAS MUESTRAS
- Colocamos la placa sobre la plantilla patrón, para que las distancias de los pocillos sean las mismas. Este paso es muy importante.
- Con una pipeta Pasteur, cortamos los pocillos. Con un movimiento suave perforamos la agarosa y retiramos los tapones con ayuda de unas pinzas.
- Debemos marcar la placa por el lateral para identificar los pocillos.
CARGA DE MUESTRAS EN LOS POCILLOS
En cada pocillo dispensamos 30ul de cada solución determinada.
PLACA 1
- Pocillo central ponemos antisuero del eppendorf A
- Pocillo superior izquierdo ponemos suero del eppendorf B
- Pocillo superior derecho ponemos suero del eppendorf B
- Pocillo inferior izquierdo ponemos suero del eppendorf B
- Pocillo inferior derecho ponemos suero del eppendorf B
- Pocillo central ponemos antisuero del eppendorf A
- Pocillo superior izquierdo ponemos suero del eppendorf B
- Pocillo superior derecho ponemos albúmina del eppendorf C
- Pocillo inferior izquierdo ponemos albúmina del eppendorf C
- Pocillo inferior derecha ponemos suero del eppendorf B
PLACA 3
Con las placas tapadas, las colocamos en la cámara húmeda de incubacion. No se Deen invertir las placas. Cubrimos la cubeta con papel de aluminio y precintada con cinta adhesiva. Lo dejamos incubar ente 24 y 48 horas para permitir que se formen líneas de precipitacion. Se introduce la cámara en un horno a 37 grados.
RESULTADO E INTERPRETACIÓN
Las líneas de precipitación serán visibles en 24-48 horas a temperatura ambiente. Sostener con cuidado la placa para que las luces superiores (del techo) de la sala brillen a través de ella.
Se deben poder ver arcos blancos opacos en cada lado de la placa donde el anticuerpo y el antígeno precipitaron. Se debe hacer un dibujo de los resultados obtenidos.
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