PRACTICA 13: INMUNOELECTROFORESIS

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR INMUNOELECTROFORESIS

INTRODUCCIÓN

La inmunoelectroforesis es una técnica de separación e identificación de sustancias (habitualmente proteínas) que atraviesa dos fases.

Durante la primera fase, separamos las proteínas de la muestra mediante una electroforesis convencional en agarosa.

En la segunda fase, se practica un carril o canal paralelo al recorrido electroforético y se rellena rellena con un Ac anti proteína adecuado.

La difusión del Ag (proteína) y del Ac (suero anti proteína) permitirá que ambos se unan y reaccionen entre sí formando un complejo Ag-Ac que se hará visible en forma de unos arcos de precipitación.

OBJETIVO 

El objetivo de esta práctica es separar las proteínas contenidas en un suero e identificar en él la posible presencia de Albúmina e Ig G. 

COMPONENTES DEL KIT 

A → Ig G

B → suero sanguíneo

C → anticuerpod frente al suero

E → anticuerpo frente a la Ig G

F → polvo de agarosa

G → tampón de electroforesis concentrado (25x)

• Papel de filtro
• Pajitas para perforar los pocillos
• Placas de petri (6 cm de diámetro)

PROCEDIMIENTO 

PREPARACIÓN DEL TAMPÓN Y EL GEL DE ELECTROFORESIS

Preparamos el tampón de electroforesis diluyendo el total (40 mL) del bote que lo contiene en forma concentrada (componente G del kit) en 960 mL de agua destilada para obtener un volumen total de tampón de 1.000 mL.

Este tampón se usará para preparar la agarosa y realizar la electroforesis. Preparamos la solución para el gel de agarosa siguiendo los pasos indicados a continuación:

1. Añadimos el contenido total del sobre que contiene la agarosa (componente F) en 100 mL del tampón de electroforesis obtenido en el paso anterior. Utilizamos un frasco erlenmeyer de 500 mL. Con un rotulador marcamos el nivel alcanzado por el tampón.
2. Tapamos el erlenmeyer y calentamos la mezcla en el microondas hasta disolver el polvo de agarosa. Al final, la solución debe ser transparente y sin partículas.
3. Dejamos enfriar la solución en el baño termostático.

Construimos un molde para los carriles.
Pipeteamos la cantidad necesaria de gel de agarosa (80-100 mL) en la bandeja de la cubeta de electroforesis procurando que cubra el fondo uniformemente y no forme burbujas. Antes de que solidifique, introducimos en el centro del gel el molde para los carriles.

Cuando el gel haya solidificado, extraemos cuidadosamente el molde para los carriles y guardamos el gel en cámara húmeda hasta el momento de su uso.

REALIZACIÓN DE LA ELECTROFORESIS

• Hacemos los pocillos en el gel con ayuda de la pajita suministrada en el kit.
• Colocamos la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis y disponemos papel de filtro en cada uno de sus extremos de manera que sobresalga hacia el exterior. Dicho papel deberá estar empapado en el tampón.
• Vertemos el tampón en cada uno de los vasos de la cubeta de electroforesis hasta llenarlos, asegurándonos de que el papel de filtro que sobresale del gel esté sumergido en el tampón. No cubrimos el gel con el tampón.
• Dispensamos 20 μL de cada Ag (A, B y C) en los pocillos correspondientes (A en el superior, B en el central y C en el inferior). Cambiamos las puntas de pipeta entre Ag y Ag.
• Cerramos la tapa de la cubeta de electroforesis y conectamos los electrodos teniendo en cuenta que los Ag a identificar están cargados negativamente.
• Conectamos la cubeta a la fuente de alimentación y aplicamos un voltaje de 125 V durante 30-45 minutos.
• Una vez finalizada la electroforesis, desconectamos la fuente de alimentación y quitamos la tapa de la cubeta. Retiramos el papel de filtro y extraemos de la cubeta la bandeja con el gel. Lo depositamos en una superficie horizontal.

DIFUSIÓN DE LOS AG Y AC

• Añadimos 50 μL de cada Ac en el carril correspondiente, procurando que se distribuya por todo el carril.
• Colocamos la bandeja con el gel en una cámara húmeda.
• Tras 24-48 horas de difusión, serán visibles los arcos de precipitación en el gel.