TECNICAS DE INMUNOLOGIA: PRACTICA 11: ESTREPTOLISINA O LIOFILIZADA

DETERMINACIÓN DEL TITULO DE ANTI-SLO

PRINCIPIO CLÍNICO
La estreptolisina O (SLO), es un purificado procedente del cultivo de estreptococos beta-hemolíticos. Se trata de un producto estandarizado para la determinación cuantitativa del titulo de antiestreptolisina O, por la técnica de inhibición de la hemólisis.
El carácter inmunogénico de la SLO permite valorar la extensión de una infección estreptocócica, por simple titulación de nivel en suero de anticuerpos anti-SLO. Diluciones crecientes del suero problema se enfrentan con una cantidad constante de SLO, en presencia de una suspensión de hematíes, determinándose la dilución de suero mas alta capaz de inhibir el poder hemolítico de la toxina. La inversa de dicha dilución corresponde al titulo del suero.

OBJETIVO
Streptococo pyogenes (estreptococo del grupo A beta-hemolítico) es la causada bacteriana más frecuente de faringitis aguda y también origina distintas infecciones cutáneas y sistemáticas. La infección puede acarrear dos secuelas, la fiebre reumática aguda y la glomerulonefritis aguda postestreptocócica.
La mayor parte de las cepas de estreptococos del grupo A también elabora una hemolisinas, la estreptolisina O provoca hemólisis de los hematíes.
La estreptolisina O tiene carácter antigénico y en la clínica, la técnica serológica mas utilizada para detectar la infección estreptocócica del grupo A, es la titulación de los anticuerpos antiestreptolisina O (ASO) en el suero del ser humano.

REACTIVOS

Estreptolisina O liofilizada

Tampón fosfato pH 6,5

Suero

Hematíes grupo O ( usamos este tipo de hematíes porque como en su superficie no hay Ag, no habrá problema de que aglutinen)

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Para preparar una suspensión de hematíes lavados, debemos diluir 5 ml de suspensión de hematíes en 95 ml de tampón fosfato

Para preparar laso dos diluciones de suero de paciente debemos:

Para 1/10 : diluir 0,2 ml de suero en 1,8 ml de tampón
Para 1/25 : diluir 0,1 ml de suero en 2,4 ml de tampón

PROCEDIMIENTO DEL MICRÓMETRO

Utilizamos placas microtiter con los pocillos en forma de V. Para cada suero diluido necesitamos dos filas de pocillos. La primera fila A será para 1/10 y la segunda fila B será para 1/25. Utilizaremos 10 pocillos, 9 para la realizar la dilución y el último para el control de SLO en el caso A y para el control de hematíes para el caso B.

Dispensamos en cada pocillo de la primera fila y de la segunda 50ul de tampón,
Añadimos 50ul de la dilución 1/10 en el primer pocillo de la fila A
Mezclamos bien, y pasamos 50ul al siguiente pocillo, efectuamos sucesivas diluciones en todos los pocillos, menos en el último que es el control
En la fila B, hacemos lo mismo, añadimos en el primer pocillo 50ul de la dilución 1/25 y vamos realizando diluciones en todos los pocillos hasta llegar al 9.
Añadimos 25ul de dilución de estreptolisina O en rehidratada a todos los pocillos de la fila A y a todos de la B, menos al ultimo. La estreptolisina O reconstruida tiene una duración de 1 hora.
Agitamos suavemente e incubamos 15 minutos a 37ºC. Lo tapamos con parafilm, para evitar evaporaciones
Transcurrido ese tiempo se añaden 25ul de suspensión de hematíes al 3% a cada pocillo.
Agitamos suavemente, dando pequeños golpecitos en la mesa, e incubamos 45 minutos a 37ºC en la estufa. Al pasar los primeros 15 minutos se debe abrir para moverlos y después dejarlos incubar el resto de minutos.
Dejamos una hora a temperatura ambiente.