PRACTICA 8: TPHA

DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS ANTI-TREPONEMA PALLIDUM

PRINCIPIO DEL MÉTODO
TPHA (Treponema Pallidum Haemagglutination) es una prueba de hemoaglutinación indirecta en microplaca para la detección cualitativa y semicualitativa de anticuerpos específicos anti-Treponema pallidum en suero humano. Los hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con una solución antigénica de T. pallidum, aglutinan en presencia de anticuerpos anti-T.pallidum mostrando unos patrones de aglutinación característicos.

SIGNIFICADO CLINICO 
La sífilis es una enfermedad venérea provocada por la infección con T. pallidum. La transmisión del microorganismo se produce por contacto directo a través de una lesión productiva. El periodo de incubación es aproximadamente de 20 días y la enfermedad progresa a través de 3 fases distintas con sintomatología diferente. L-s anticuerpos anti-Treponema aparecen a partir de la primera fase y pueden permanecer en un 85-90 % de pacientes tratados a pesar de haber superado la enfermedad. 

REACTIVOS 
R1: Células test (TC)           Hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con antígenos de T.                                                        pallidum. Están recubiertos con espiroquetas
R2: Células Control (CC)   Supensión estabilizada de hematíes de ave.
R3: Diluyente (DIL)            Tampón fosfato, extracto de T. pallidum.
Control +                              Suero inmune humano prediluido (1:20)
Control -                               Suero de animal 

PROCEDIMIENTO
No hacemos controles (+ y -) porque usamos como paciente el control +.

1. Atemperamos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente
2. Prepara una dilución 1:20 de la muestra en diluyente, Mezclamos 10ul de suero con 190ul de diluyente.
3. Antes de usar los reactivos R1 y R2 se deben agitar vigorosamente porque tiene partículas en suspensión que se asolan muy facilmente.
4. Pipeteamos en la primera fila, pocillo 1: 25ul de muestra + 75ul de R2. En el pocillo 2: 25ul de muestra + 75ul de R1
   
5. En la segunda fila pipeteamos 25ul de R3 en 4 pocillos, y añadimos 25ul de muestra en el primer pocillo, homogeneizamos y pasamos 25ul al segundo pocillo, lo mismo lo repetimos en el 3 y 4, que desechamos 25ul.
   
   
6. Añadimos 75ul de R1 en cada pocillo. 
7. Agitamos suavemente la placa para completar la homogenización de las mezclas
8. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 45-60 minutos. Colocar en una superficie plana y libre de corrientes de aire, vibraciones, calor y luz solar 

LECTURA E INTERPRETACIÓN

Nuestro resultado no sale correcto, no se ve aglutinación en ningún pocillo.

Pero el resultado debería de ser:

• El control negativo no debe mostrar aglutinación con células Test ni con células control.
• El control positivo solo debe mostrar aglutinación en las células Test. Si aparece aglutinación indica presencia de anticuerpos inespecíficos y no debe valorarse
• Las muestras positivas deben ser tituladas según el procedimiento semicualitativo. Se define el titulo como la dilución mayor que da resultado el reactivo

Esta foto es de unas compañeras de clase que si le salio correcto

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