PRACTICA 10: INMUNOGLOBULINA M

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE INMUNOGLOBULINA M

PRINCIPIO DEL MEDIO
Los anticuerpos anti-IgM forman compuestos insolubles cuando se combinan con la IgM de la muestra del paciente, ocasionando un cambio de absorbancia proporcional a la concentración de IgM en la muestra, y que puede ser cuantificada por comparación con un calibrador de IgM de concentración conocida.

SIGNIFICADO CLÍNICO
la IgM es la única inmunoglobulina que sintetiza el recién nacido. En adultos representa el 5-10% del total de inmunoglobulinas. Su estructura es pentamérica y su elevado peso molecular (900.000daltons) evita su paso a espacios extra celulares.
Su concentración se halla disminuida en enfermedades relacionadas con deficiencias hereditarias o adquiridas de la producción de inmunoglobulinas. La respuesta normal a las infecciones consiste en aumentar la producción inmunoglobulinas. La IgM generalmente aumenta en infecciones víricas e infecciones del torrente circulatorio como la malaria y la cirrosis biliar primaria En caso de mieloma múltiple, si la paraproteína es una IgM, probablemente se trate de una macroglobulinemia de Waldenström. Las crioglobulinemias de origen monoclonal, son generalmente debidas a IgM.

FUNDAMENTO 
La Inmunoturnidimetría e Inmunonefelometría se basa en la detección de los complejos Ag-Ac por la refracción que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el anticuerpo correspondiente.

• Inmunoturbidimetría: mide la disminución de la luz transmitisa a través de la suspensión de inmunocomplejos formados utilizando para ello un espectrofotómetro 
• Inmunonefelometría: la medición de la luz dispersada se realiza en un angulo de 45º y en lugar de utilizar un espectrofotómetro se utiliza un nefelometro.

En función del momento de la reacción en que se realizan las medidas de disminución de la radiación, podemos distinguir dos tipos:

• A punto final: Se realizan únicamente dos medias, una al principio de la reacción y otra a tiempo prefijado en la zona de equilibrio de la misma
• Cinética: Se realiza una lectura múltiple (mínimo 2 puntos) a lo largo de la reacción inmunológica, valorando la velocidad de formación de inmunocomplejos. 

Estas técnicas se utilizan en la cuantficación de proteínas como:Inmunoglobulinas G, A, M, Transferrina, ASLO, Microalbumina, Ferritina, etc...

REACTIVOS 
R1 : Diluyente; tampón tris 20mmol/l
R2: Anticuerpo; suero de cabra anti-IgM humana

PROCEDIMIENTO 

• Calentamos los reactivos y encendemos el fotómetro. La longitud de onda utilizada es de 340nm
• Ajustamos el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
• Preparamos en una gradilla seis tubos marcados

• Cogemos 10ul de cada uno y añadimos 800ul
  
  
  
  
  
  
• Medimos la absorbancia
  
  Valores obtenidos:
  A1: 0,214
  A2: 0,219
  A3: 0,221
  A4: 0,225
  A5: 0,720
  A6: 0,289
  
  
• Añadimos a cada uno 200ul de R2 y esperamos 2 minutos para volver a medir.
  
  
  
  Valores obtenidos:
  A1: 0,241
  A2: 0,316
  A3: 0,467
  A4: 0,580
  A5: 0,703
  A6: 1,341 
  
  
  CALCULOS
  Calculamos la diferencia entre las absorbancias obtenidas para los distintos calibradores. 
  (A2-A1).
  Tubo 1: 0,241-0,214 = 0,101 A
  Tubo 2: 0,219 - 0,316 = 0,097 A
  Tubo 3: 0,221 - 0,467 = 0,246 A
  Tubo 4: 0,225 - 0,580 = 0,335 A
  Tubo 5: 0,720 - 0,703 = 0,017 A
  Tubo 6: 0,289 - 1,341 = 1,052 A
  
  Con los datos obtenidos hacemos una curva de calibración
  

  

  
  

  Ahora hacemos lo mismo con el tubo problema, medimos las dos absorbancias y las restamos. Con la función asociada a la recta de regresión podemos calcular la concentración de la muestra problema. En nuestro caso lo hemos hecho con dos muestras problemas:

  MUESTRA               A1                 A2              A2-A1

  RUTH                     0,076             0,336          0,260

  DERAY                  0,080              0,355         0,275

  
  

  Como Y = 0,0033x-0,0288

  RUTH: X = (0,260 + 0,0288) / 0,0033 = 87,51 mg/dL

  DERAY X = (0,275 + 0,0288)/0,0033 = 92,06 mg/dL