PRACTICA 14: RUBEOLA IgG ELISA

PRÁCTICA 14: RUBÉOLA IG G - ELISA SIGNIFICADO CLINICO El rubelavirus es un virus de ARN con envoltura de cadena simple que pertenece al grupo de los Togavirus. Tiene una forma esférica y un diámetro de 50 a 70 nm. Parece de existir solamente un tipo de antígeno porque no se encontraron reacciones cruzadas con Alphavirus o otros Togavirus.
Los virus de rubeóla son patógeno de la zona respiratoria y transmitidos principalmente por la transferencia de las gotas contaminadas. Rubeóla es una enfermedad contagiosa común mundialmente con síntomas constitucionales suaves y las acometidas generalizadas. En niños, es una enfermedad inconsecuente, pero cuando ocurre durante el embarazo, hay un riesgo significativo del daño severo al feto.
El riesgo de rubeóla congénita depende saber todo el mes del embarazo en el cual se adquiere la infección. En total, aproximadamente 16% de infantes tienen defectos grandes en el nacimiento que sigue rubeóla maternal en los primeros 3 meses de gestación.
Rubeóla congénita puede conducir a un síndrome con implicaciones solas o múltiplas de los órganos, conocido como embriopatía de la rubeóla. En algunos casos la infección no es aparente pero resulta en daños consecuentes tales como defectos del ojo, sordera, retraso del crecimiento y otros.
Generalmente, inmunidad adquirida naturalmente es duradero, pero la re-infección es posible debido a los niveles de anticuerpos circulantes. Para la inmunización se utiliza una vacuna que contiene virus vivo.

COMPONENTES DEL KIT

• Micro tiras de IgG recubiertas de Ag de rubéola.
• Calibradores (A-E) → suero humano diluido con PBS → listos para usar.
• Conjugado de Ig G antihumana (15 mL) → listo para usar.
• Sustrato → listo para usar.
• Solución de parada → lista para usar.
• Solución diluyente para la muestra → lista para usar.
• Solución de lavado (10x)

MUESTRA

Suero o plasma. 

Diluimos la muestra con el diluyente → 1/101 (5 μL muestra + 500 μL diluyente).

PROCEDIMIENTO

Preparamos un pocillo para el blanco del sustrato, 5 pocillos para los calibradores y 1 pocillo para la muestra.

Pipeteamos 100 μL en cada pocillo de calibradores.

Pipeteamos 100 μL de muestra diluida en el pocillo 6.

Dejamos el primer pocillo vacío para el blanco del sustrato.
Incubamos (tapándolo) durante 60 minutos a temperatura ambiente.

Tras incubar, aspiramos el líquido de la tira. Lavamos tres veces con 300 μL de solución de lavado, evitando que rebose.
Para eliminar el resto del buffer, golpeamos con cuidado sobre una servilleta.

Pipeteamos 100 μL de conjugado anti Ig G. Dejamos el blanco vacío. Cubrimos e incubamos 30 minutos a temperatura ambiente. Volvemos a lavar otras tres veces con la solución de lavado
Pipeteamos 100 μL de sustrato, incluido el pocillo del blanco de sustrato.

Cubrimos e incubamos 20 minutos a oscuras en un cajón.
Pipeteamos 100 μL de solución de parada, incluido el pocillo del blanco de sustrato.

Medimos la absorbancia a 450 nm o 620 nm. El color es estable durante 60 minutos.

MEDICIÓN
Efectuamos la calibración a 0 con el lector de ELISA.
Medimos la absorbancia de todos los pocillos (450 nm).
Anotamos los resultados de los controles y la muestra.
Si la calibración a 0 no es posible automáticamente, restamos el valor del pocillo blanco al resto.

PRACTICA 13: INMUNOELECTROFORESIS

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR INMUNOELECTROFORESIS

INTRODUCCIÓN

La inmunoelectroforesis es una técnica de separación e identificación de sustancias (habitualmente proteínas) que atraviesa dos fases.

Durante la primera fase, separamos las proteínas de la muestra mediante una electroforesis convencional en agarosa.

En la segunda fase, se practica un carril o canal paralelo al recorrido electroforético y se rellena rellena con un Ac anti proteína adecuado.

La difusión del Ag (proteína) y del Ac (suero anti proteína) permitirá que ambos se unan y reaccionen entre sí formando un complejo Ag-Ac que se hará visible en forma de unos arcos de precipitación.

OBJETIVO 

El objetivo de esta práctica es separar las proteínas contenidas en un suero e identificar en él la posible presencia de Albúmina e Ig G. 

COMPONENTES DEL KIT 

A → Ig G

B → suero sanguíneo

C → anticuerpod frente al suero

E → anticuerpo frente a la Ig G

F → polvo de agarosa

G → tampón de electroforesis concentrado (25x)

• Papel de filtro
• Pajitas para perforar los pocillos
• Placas de petri (6 cm de diámetro)

PROCEDIMIENTO 

PREPARACIÓN DEL TAMPÓN Y EL GEL DE ELECTROFORESIS

Preparamos el tampón de electroforesis diluyendo el total (40 mL) del bote que lo contiene en forma concentrada (componente G del kit) en 960 mL de agua destilada para obtener un volumen total de tampón de 1.000 mL.

Este tampón se usará para preparar la agarosa y realizar la electroforesis. Preparamos la solución para el gel de agarosa siguiendo los pasos indicados a continuación:

1. Añadimos el contenido total del sobre que contiene la agarosa (componente F) en 100 mL del tampón de electroforesis obtenido en el paso anterior. Utilizamos un frasco erlenmeyer de 500 mL. Con un rotulador marcamos el nivel alcanzado por el tampón.
2. Tapamos el erlenmeyer y calentamos la mezcla en el microondas hasta disolver el polvo de agarosa. Al final, la solución debe ser transparente y sin partículas.
3. Dejamos enfriar la solución en el baño termostático.

Construimos un molde para los carriles.
Pipeteamos la cantidad necesaria de gel de agarosa (80-100 mL) en la bandeja de la cubeta de electroforesis procurando que cubra el fondo uniformemente y no forme burbujas. Antes de que solidifique, introducimos en el centro del gel el molde para los carriles.

Cuando el gel haya solidificado, extraemos cuidadosamente el molde para los carriles y guardamos el gel en cámara húmeda hasta el momento de su uso.

REALIZACIÓN DE LA ELECTROFORESIS

• Hacemos los pocillos en el gel con ayuda de la pajita suministrada en el kit.
• Colocamos la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis y disponemos papel de filtro en cada uno de sus extremos de manera que sobresalga hacia el exterior. Dicho papel deberá estar empapado en el tampón.
• Vertemos el tampón en cada uno de los vasos de la cubeta de electroforesis hasta llenarlos, asegurándonos de que el papel de filtro que sobresale del gel esté sumergido en el tampón. No cubrimos el gel con el tampón.
• Dispensamos 20 μL de cada Ag (A, B y C) en los pocillos correspondientes (A en el superior, B en el central y C en el inferior). Cambiamos las puntas de pipeta entre Ag y Ag.
• Cerramos la tapa de la cubeta de electroforesis y conectamos los electrodos teniendo en cuenta que los Ag a identificar están cargados negativamente.
• Conectamos la cubeta a la fuente de alimentación y aplicamos un voltaje de 125 V durante 30-45 minutos.
• Una vez finalizada la electroforesis, desconectamos la fuente de alimentación y quitamos la tapa de la cubeta. Retiramos el papel de filtro y extraemos de la cubeta la bandeja con el gel. Lo depositamos en una superficie horizontal.

DIFUSIÓN DE LOS AG Y AC

• Añadimos 50 μL de cada Ac en el carril correspondiente, procurando que se distribuya por todo el carril.
• Colocamos la bandeja con el gel en una cámara húmeda.
• Tras 24-48 horas de difusión, serán visibles los arcos de precipitación en el gel.

PRACTICA 12: INTERACCION Ag-Ac

INTERACCIÓN Ag-AC EL PROCEDIMIENTO OUCHTERLONY

INTRODUCCION
Las interacciones de un Ac con un Ag es la reacción fundamental de la inmunología. La mayoría de los Ag son proteinas. La identidad exacta de los grupos que reacciona con el Ac no se conoce. Los Ag y Ac forman complejos que se vuelven insolubles y precipitan. Esta propiedad hace posible realizar ensayos cualitativos y cuantitativos.
La precipitación del Ag, tiene varios determinantes antigenicos por molécula a los que se pueden unir los Ac. Los anticuerpos tienen dos sitios de unión al Ag, por lo que se forman grandes agregados.
ZONA DE EXCESO DE ANTICUERPOS: es la zona donde se agrega una cantidad creciente de Ag a una cantidad constante de Ac.
ZONA DE EQUICALENCIA O PUNTO DE EQUIVALENCIA: a medida de que se agrega más Ag, la cantidad de proteína precipitada aumenta hasta que las moléculas de Ag-Ac están en proporción optima.
ZONA DE EXCESO DE ANTÍGENO: ocurre cuando la cantidad de Ag en solución excede a la cantidad de Ac, la cantidad de precipitación disminuira.
Cuando los Ac y Ag se insertan en diferentes áreas de un gel de agarosa, se difunden uno hacia el otro y forman bandas opacas de precipitado en la interfaz de sus frentes de difusión.


OBJETIVO DEL EXPERIMENTO
El objetivo del este experimento es introducir los principios de las interacciones Ag/Ac usando el procedimiento Ouchterlony.

PROCEDIMIENTO DE OUCHTERLONY
La doble difusión den dos dimensiones es un procedimiento simple. Las soluciones de Ag y Ac se colocan en pocillos separados y cortados en una placa de agarosa. Los reactivos se difunden desde los pocillos uno haci aelotro y precipitan donde se encuentran en proporciones equivalentes. Un único Ag se combina con su Ac homólogo para formar una única línea de precipitación. Cuando dos Ag están presentes, cada uno se compra independientemente el uno del otro, por lo que el número de bandas de precipitación indica que hay al menos muchos pares de Ac y Ag presentes.
Está tecnica es muy útil para compara Ag para un número determinantes idénticos o de reacción cruzada.
REACCIÓN DE IDENTIDAD: se conoce como la fusión de los extremos de dos bandas de precipitación de dos Ag colocados en pocillos adyacentes y el Ac homologo.
REACCIÓN DE NO IDENTIDAD: sucede al colocar Ag no relacionados en pocillos adyacentes y en el pocillo central se colocan Ac para cada Ag, las bandas de precipitación formadas se cruzarán
REACCIÓN DE IDENTIDAD PARCIAL: consiste en la reacción cruzada de dos Ag  colocados en pocillos periféricos adyacentes contra uno en el pocillos central, y se obtiene una banda única con el Ag homologo y de reacción cruzada. Como el Ag de reaccion cruzada carece de algunos determinantes antigenicos presentes en el Ag homologo, no puede precipitar todo el Ac. El Ac restante se difundirá más allá de la línea de precipitado de reacción cruzada que reacciona con el Ag homologo para producir un espolon. Este espolon formará proyecciones hacia el Ag con menos determinantes.

MATERIALES UTILIZADO

• Antisuero (Ac)
• Suero total (Ag)
• Albúmina (Ag)
• IgG (Ag)
• Tampon
• Agarosa
• Micro pipetas
• Plantillas para corte de pocillos
• Placas de Petri
  
  
  
  
  
  

PREPARACIÓN DE LA CÁMARA DE INCUBACIÓN
En una cubeta colocamos papel absorbente mojado con agua destilada. El papel debe estar empapado, y no dejado capa de agua liquida. Una vez que colocamos las placaa, debemos taparla con una envoltura de papel de aluminio y lo sellamos con cinta adhesiva.

PREPARACIÓN DE ANTICUERPO Y ANTIGENOS
Preparamos alícuotas para todos los grupos de Ac y de los tres Ag.
Etiquetados 9 eppenderf con A, otros 9 con B, otros 9 con C y los últimos 9 con D.

• En los eppendorf etiquetados con A, alícuotamos 100ul de antisuero
• En los eppendorf etiquetados con B, alícuotamos 200ul de suero total
• En los eppendorf etiquetados con C, alícuotamos 150ul de albumina
• En los eppendorf etiquetados con D, alícuotamos 80ul de IgG

A cada grupo repartimos un eppendorf de cada para realizar el ensayo.

PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA

• En un matraz aforado de 500ml, agregamos el contenido de tampón y lo diluimos en 225ml de agua destilada. Agitamos con una varilla y disolvemos completamente. 
• Vertemos en contenido del sobre de agarosa y disolvemos completamente. Con un rotulador, marcamos donde está el nivel del volumen.
• Tapamos el matraz con un tapón de algodón o con un poco de paraflim y calentamos en el microondas hasta llegar a ebullición, para disolver la agarosa. Durante el calentamiento vamos agitando en varias ocasiones observando que no queden partículas pequeñas y que la agarosa se va volviendo transparente. La solución final debe ser clara y transparente.
• Si observamos que se ha evaporado, debemos agregar agua destilada hasta la línea marcada. El volumen debe ser 230 ml.
• Enfriamos la solución a 55 grados en un ba;o maría. Agitamos el matraz para facilitar la disipación del calor
• Una vez alcanzada la temperatura, tranferimos 25 ml en cada placa.
  
  
  
  
  
  
  
  

PREPARACIÓN DE PLACAS DE OUCHTERLONY

Repartimos a cada grupo 3 placas de Petri. Con una pipeta de 5ml, tranferimos a las placas para cubrir el fondo con agarosa. Debemos evitar la formación de burbujas de aire, si esto ocurre, con ayuda de una punta de pipeta la explotamos o la llevamos al lateral para que no interfiera. Dejamos enfriar en posicion horizontal hasta que solidifique. Aproximadamente 10 o 15 minutos

PREPARACIÓN DE POCILLOS PARA LAS MUESTRAS

• Colocamos la placa sobre la plantilla patrón, para que las distancias de los pocillos sean las mismas. Este paso es muy importante. 
• Con una pipeta Pasteur, cortamos los pocillos. Con un movimiento suave perforamos la agarosa y retiramos los tapones con ayuda de unas pinzas.
• Debemos marcar la placa por el lateral para identificar los pocillos.
  
  
  

CARGA DE MUESTRAS EN LOS POCILLOS

En cada pocillo dispensamos 30ul de cada solución determinada.

PLACA 1

• Pocillo central ponemos antisuero del eppendorf A
• Pocillo superior izquierdo ponemos suero del eppendorf B
• Pocillo superior derecho ponemos suero del eppendorf B
• Pocillo inferior  izquierdo ponemos suero del eppendorf B
• Pocillo inferior derecho ponemos suero del eppendorf B

PLACA 2

• Pocillo central ponemos antisuero del eppendorf A
• Pocillo superior izquierdo ponemos suero del eppendorf B
• Pocillo superior derecho ponemos albúmina del eppendorf C
• Pocillo inferior izquierdo ponemos albúmina del eppendorf C
• Pocillo inferior derecha ponemos suero del eppendorf B

PLACA 3

• Pocillo central ponemos antisuero del eppendorf A
• Pocillo superior izquierdo ponemos IgG del eppendorf D
• Pocillo superior derecho ponemos albúmina del eppendorf C
• Pocillo inferior izquierdo ponemos albúmina del eppendorf C
  
• Pocillo inferior derecho ponemos IgG del eppendorf D
  
  
  
  
  
  
  

INCUBACIÓN 

Con las placas tapadas, las colocamos en la cámara húmeda de incubacion. No se Deen invertir las placas. Cubrimos la cubeta con papel de aluminio y precintada con cinta adhesiva. Lo dejamos incubar ente 24 y 48 horas para permitir que se formen líneas de precipitacion. Se introduce la cámara en un horno a 37 grados.

RESULTADO E INTERPRETACIÓN 

Las líneas de precipitación serán visibles en 24-48 horas a temperatura ambiente. Sostener con cuidado la placa para que las luces superiores (del techo) de la sala brillen a través de ella. 

Se deben poder ver arcos blancos opacos en cada lado de la placa donde el anticuerpo y el antígeno precipitaron. Se debe hacer un dibujo de los resultados obtenidos.